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毕业设计ppt答辩模板,怎么做网站优化 sit,如何学习网页设计网页,邢台视频优化问题1.为什么免疫后没有效价或免疫后效价低#xff1f;答#xff1a;可以从这几个方面去查找原因#xff1a; #xff08;1#xff09;免疫的抗原#xff0c;分子量和抗原性是否合适#xff1b;分子量最好不小于25kDa;对于小分子化合物或者多肽#xff0c;需要偶联载体…问题1.为什么免疫后没有效价或免疫后效价低答可以从这几个方面去查找原因1免疫的抗原分子量和抗原性是否合适分子量最好不小于25kDa;对于小分子化合物或者多肽需要偶联载体蛋白比如KLH,OVA或者KLH一般选KLH;(2)免疫的佐剂是否合适免疫的佐剂常用的是弗氏完全佐剂与不完全佐剂可以试试其他的佐剂比如水溶性佐剂3免疫程序是否合适不同佐剂需要设计不同的免疫程序一般免疫三次后效价依然没有起色的话就需要重新考虑目前的抗原设计、抗原和免疫程序问题4免疫计量问题蛋白类抗原免疫之前通过SDS-PAGE确定蛋白量的问题比其他蛋白浓度测定方法更靠谱每种蛋白浓度测定方法都有其缺陷5免疫方式问题免疫的时候尽可能多点多部位必要的时候可以配合脾脏免疫和尾静脉免疫6效价测定的问题测免疫效价一般采用间接ELISA法这个方法需要搭建好ELISA测定程序比如抗原包被的最佳浓度选择二抗使用浓度底物灵敏度另外对于不同浓度的抗原对其效价的评价需要区别对待对于抗原性比较较弱的1:10000以上就是非常好的选择对于小分子效价1:3000也算成功。问题2:融合后细胞不长或者融合后克隆很少最重要的制约因素血清融合剂PEGSP2/0状态小鼠种系1培养基和血清问题特别是血清市面上的血清良莠不齐不管是什么牌子的需要亲自做融合测试筛选筛选到最适合融合培养的这个工作量有点大很多人不愿意去做2融合试剂PEG问题这个其实是很简单的问题可以买大牌成品的融合剂比如Sigma P7181,也可以买大品牌的干粉自己配制这需要实验室的实验用水比较过关3免疫所用的Balb/C小鼠品系是否纯正如果品系不纯正即使融合成功后期在亚克隆过程中细胞株养不活后者分泌抗体能力越来越弱。4HAT和HT浓度要合适如果对于HT好HAT试剂组分浓度计算不是特别熟悉或者来源不是特别的纯正的最好购买商业化的配制好的自己配制的话要做细胞培养浓度测试这个实验步骤繁琐。5饲养细胞问题传统教科书上融合后铺板需要加入饲养细胞其实如果血清出色并不需要添加饲养细胞添加饲养细胞无形中还增加了污染的可能我可能用融合专用血清15%-20%浓度一个老鼠脾脏细胞与一个T75细胞培养瓶的SP2/0融合铺板12-15块根本不用加入饲养细胞当然这也需要看免疫的脾脏的大小不同的老鼠和不同免疫抗原免疫出来的脾脏的大小差异还是很大。饲养细胞的作用是临时提供细胞因子和伴侣支持6铺板的密度问题建议每个96孔的板孔铺总细胞数量在100000个左右为宜。7细胞可能被污染。细菌污染很容易观察培养基很快会变浑浊培养基变得很黄真菌污染也很容易判断支原体污染不容易辨别和发现可以通过试剂盒检测。8已经问题培养箱温度湿度和CO2浓度是否合适如果不合适细胞可能不能很好生长特别是大实验室培养细胞的人很多共用一个培养箱反复开关CO2浓度、温度和湿度都很难保证稳定。3. 融合后检测不到阳性克隆1 检测方案是否正确有没有做平行的阳性对照2 检测系统与培养液里面的成分干扰了3 融合的集落太小分泌的抗体太少4 长起来的集落是假融合HAT失活细胞或者不正常的集落4. 融合后检测是满板的阳性1建立有效的检测方法上文已经提及检测时同时设置平行的阴阳性对照孔2培养基富营养化未融合的细胞存活时间太长分泌大量阳性抗体在孔里解决方案置换培养液之后再次检测3每个细胞板孔细胞集落太多解决方案稀释转板培养之后等生长起来再次检测5.融合后的细胞生长很慢1培养液特别是血清不太适合细胞生长一定要选用优质适合杂交瘤生长的血清2培养耗材对细胞生长不太友好3细胞量比较少的时候比如亚克的时候可以适当添加饲养细胞或者杂交瘤克隆生长因子4细胞存在污染比如支原体污染有的甚至导致细胞死亡5确实有个别细胞对于营养的需求比较特殊不容易生长或者生长缓慢但是分泌抗体能力很强一个孔里有几个细胞就检测到超强的信号。6. 经过几轮亚克阳性的克隆变成阴性1细胞株不纯不分泌的细胞占据优势亚克隆的过程中阳性细胞没有分种到细胞孔里或者及时分种到了克隆没有长起来自然没有筛选到阳性克隆2细胞株不稳定容易发生染色体丢失所以再细胞传代的过程中需要经常做一下亚克隆3细胞生长的环境不友好比如把细胞培养老了半死不活的再救回来可能很多细胞已经变性了4细胞被污染了也很容易不再分泌抗体最典型的就是支原体污染7. 为什么亚克隆长不出克隆1培养基不给力加点杂交瘤细胞生长因子加入适量的饲养细胞每孔100000个2用于亚克隆的母细胞状态不好3)亚克隆时细胞计数不准或者计算错误4细胞被污染了最典型的就是支原体污染5使用HAT培养的细胞在亚克隆时候培养液里要添加HT原因是上一步骤HAT中的A残留如果不添加HT会使细胞致死6其他的硬件问题与上面的内容相同。8. 杂交瘤注射到小鼠腹腔不产腹水只长实体瘤或者产生的腹水没有效价1小鼠种系不纯容易不产腹水或者产生的腹水没有效价2致敏剂不太好或者使用量不够每只老鼠可以打0.6-0.8ml,隔一周再打一次两次致敏以后再注射杂交瘤细胞3注射腹腔内的细胞量不够每次每只老鼠注射10^5-10^6个细胞用灭菌的PBS或者不完全培养基悬浮体积0.5-1ml(4)产生过多实体瘤的原因可能是在主色的时候刺伤了腹腔皮下或肌肉或者肠道没有将细胞充分注射到腹腔内手法很重要5杂交瘤所产生的抗体与小鼠体内的某个分子特异性结合产生的抗体被中和这类抗体针对的靶蛋白与小鼠自身的蛋白物质序列高度同源。9. 杂交瘤细胞冻存复苏不活1培养液的配方和关键试剂血清和DMSODMSO一定要选择适合细胞培养级别的配方含有10% DMSO冻存液至少含有10%-50%的血清2细胞本身的原因让细胞处于最佳状态对数生长时期细胞数量10^6/ml的浓度比较合适3冻存的过程中梯度降温很重要最简单的方法将细胞冻存管裹在厚厚的棉花里埋在干冰里或者塞在液氮罐的气相过夜第二天放到液氮里我们用这个方法从来没有失手。4解冻的过程中调一大烧杯的热水热水的稳定稍微高一点41℃-42℃不停的搅动直到完全解冻吸取冻存的细胞转入到15ml离心管再补满不完全培养基混匀离心弃掉上清。细胞沉淀用完全培养基重选培养。5细胞冻存的液氮罐定期维护补加液氮不要液面太低或者液氮挥发完了、10.细胞污染的挽救细胞的污染大致可以分三类细菌污染、真菌污染和支原体污染还可能由不明微生物污染。1细菌污染可以加大抗生素浓度将细胞稀释培养抗生素浓度加到原来10倍每隔12小时换液反复几次2真菌污染的话从两种抗生素加到三种抗生素比如我们常用的抗生素是链霉素和青霉素可以再加一个两性霉素B,或者制霉菌素将细胞稀释培养多次换液坚持培养一周。3支原体污染如果轻度污染可以试试使用60 ug/ml的泰乐菌素和10 ug/ml左右的环丙沙星交替处理我们还新研发的支原体处理试剂效果比较好也是稀释培养多次换液坚持培养一周。4利用动物免疫系统清除将污染的细胞注射到小鼠背部或者腹腔等实体瘤快长成的时候再无菌超净台上取下实体瘤再次培养。